介绍

基于重力柱的液相色谱纯化方法是一种常见但速度缓慢且资源集中的化合物纯化技术。将重力法过渡到自动 Flash 色谱法大大提高了进样量，减少了运行时间，并减少了纯化过程中使用的溶剂。在本文中，将重力柱色谱技术与基于分离两种染料的 Pure C-815 Flash 系统的 Flash 法进行了比较。Pure Navigator™ 软件可用于计算优化使用不含氯的溶剂梯度解决方案。优化的溶剂系统允许每次运行能纯化更多的样品。

设备、试剂和材料

设备：

• 重力柱色谱，玻璃柱中填充了硅胶和 FC60 支架

• C-815 快速色谱系统，由三活塞泵、200nm-800nm 紫外线检测器、DAD、ELSD、封闭式馏分收集器，18x150mm 支架组成

• Flash 色谱柱，FlashPure EcoFlex Silica 12g（50μm）和FlashPure Select Silica 12g（15μm）

试剂和材料：

• 苏丹黄

• 苏丹红 G

• 硅胶（50μm）

• 己烷

• 乙酸乙酯

• 二氯甲烷（DCM）

实验流程

样品：

分别取 25mg 苏丹黄和苏丹红，溶解在 50mL 二氯甲烷中。对于 实验3 和 实验4，将 25mg 苏丹黄和 25mg 苏丹红溶于 50mL 己烷/乙酸乙酯 7:3 V/V 中。

分离：

用相同质量的硅胶（12g 作为固定相）填充玻璃柱和预填充的色谱柱。将 12g 硅胶和约 60mL 二氯甲烷的浆料混合物填充到玻璃柱中。将硅胶色谱柱以 20mL 二氯甲烷/分钟的流速处理 2 分钟。将染料溶液加载到两个柱中，并开始洗脱程序（详细信息见 表1）。使用 Pure Navigator™ 软件计算的己烷/乙酸乙酯进行梯度分离， 3:10 至 1:2 梯度分离分离 2 分钟，保持 1:2 等度 2 分钟。进行分离实验来确定可以最大分离的，并观察两种染料是否充分分离。

实验结果

比较 FlashPure EcoFlex 硅胶柱与敞口玻璃柱

在所有条件下，染料溶液似乎都被分离成红色和黄色成分(图1)。

预填充色谱柱比自填充柱表现更好，所收集的馏分的颜色分离更干净(图2)。对于使用等压二氯甲烷流动相系统的分离，性能上的差异可以与 Flash 相对于重力柱的效率和流速的提高有关。

将流动相改为己烷和乙酸乙酯，采用线性梯度进一步优化了分离效果。在这些实验中，可以根据染料的 Rf 值定制色谱条件，最大限度地提高进样能力和纯度。

Flash 色谱法优化

进一步修改了上样量、预填充柱类型、溶剂系统和溶剂体积，以调整闪蒸色谱法的性能，并建立溶剂使用和成本的估计。实验参数、实验时间、实验结果见 表1。

在 Pure C-815 Flash上，样本在 EcoFlex 硅胶色谱柱中分离纯化，带有等度洗脱(二氯甲烷，实验2)和梯度洗脱（己烷/乙酸乙酯，实验3）。切换到梯度模式有助于增加样品的进样量(从 0.5mL 到 1mL)和分离效率（见 图3 和 图4）。

最好的结果可以通过使用高性能 FlashPure Select 硅胶色谱柱 (实验4)来实现，即使在高 4 倍的进样量的情况下（见 图5），也能提供更好的分辨率，比 实验1提高 62.5%。

溶剂节约和 ROI

运行成本（对美国而言）是根据 实验1 和 实验4 的实验参数估算的，使用的是 Fisher Scientific 公布的溶剂目录价格，以及 FlashPure 在发布时的一次性色谱柱的目录价格。假定作业人员的工资为每小时 $22.50，并列入业务费用概算。重力法的启动成本，包括玻璃柱、带底座的垂直支架、馏分收集架和硅胶填料的价格。 Flash 色谱法的启动成本，包括 Pure C-815 和色谱架的成本。所有数据归一化，以显示每 1.0mL 进样量的染料混合物所需的成本和时间。

表2a：使用敞口玻璃柱的重力色谱的启动和运行成本，成本是基于在美国的定价。

表2b：使用 Flash 色谱法的启动和操作成本，成本是基于在美国的定价。

基于以上信息，重力色谱法和 Flash 色谱法的累积成本相等的点大约是 754 次。如果实验室通常每天进行两次重力纯化，并使用 Flash 色谱法切换到每天两次运行，则投资回报率将在 377 个工作日内达到。然而，如果实验室每天进行更多的 5-10 次 Flash 纯化，则盈亏平衡点将在 75 至 150 个工作日之间发生。

结论

使用等效的溶剂系统，将开柱法染料纯化过渡到自动化的 Pure C-815 快速色谱系统，可以节省大量的时间和成本，同时还降低了与柱制备相关的操作风险，并提高了所得馏分的纯度。通过使用 Pure Navigator™ 产生适当的二元溶剂梯度，进一步优化了纯化，同时消除了氯化溶剂系统的需要。这种方法提供了更高的进样能力，更高的产品纯度和最佳的效率，同时减少了操作员接触潜在危险的硅胶及氯化溶剂。

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